N-acetyl cysteine decreases migratory capacity and increases endoplasmic reticulum stress in endometriotic cells with time and dose-dependent use

INTRODUCTION: Endometriosis is a chronic condition that affects women of reproductive age and is linked to infertility and pelvic pain. There hasn’t been a curative treatment for the condition either, only anti-inflammatory drugs, analgesic drugs, and laparoscopy. An anti-oxidant N-acetylcysteine (NAC) restores glutathione (GSH). N-acetylcysteine has been used to treat endometriosis both in vivo and in vitro in a small number of trials. In vivo and in vitro studies have shown that NAC lowers inflammation and ectopic endometrial development. In this study, we aimed to decrease the proliferative capacity as well as the migratory behavior of the endometriotic cells by using the IC50 level of NAC.
METHODS: HESC and 12Z human endometrial and endometriotic stromal cell lines were expansed according to the manufacturer’s instructions. Impedance measurements were performed on the xCELLigence (RTCA) device to determine cellular impedance. N-acetyl cysteine was applied to the cells at doses between 10-6-10-12 M, and the IC50 for NAC was calculated. The cells were treated with IC50 NAC, and the wound healing was analyzed at 0, 24, and 48 hours. GRP78, ER tracker, and tubulin-specific immunofluorescent labelings were performed. The corrected total cell fluorescence (CTCF) was counted for each sample. The GraphPad Prism 8 program was used for statistical analysis. The Shapiro-Wilk test, Mann-Whitney U test, Kruskal-Wallis test, and posthoc Dunn tests were done.
RESULTS: 12Z cell proliferation was decreased by 10-6-10-12 M NAC, while HESC cell proliferation was unaffected. The IC50 for 12Z cells was determined as 3.87 x 10-9 M. The wound gap width of 12Z cells treated with NAC was substantially wider at 48 hours into the migration test than that of the control. N-acetyl cysteine treated 12Z cells exhibited increased ER-tracker and GRP78 fluorescent immunolabeling, but decreased tubulin labeling. N-acetyl cysteine did not significantly alter the immunofluorescence labeling for those proteins in HESC cells.
DISCUSSION AND CONCLUSION: Endometriosis is a severe, ongoing condition that primarily affects females who are fertile and is linked to infertility. Therefore, we demonstrated that application of NAC in a time-dose and impedance-dependent manner helped decrease the proliferative and migratory capacity of endometriotic cells, lowering the expression of the tubulin protein, raising ER stress, and consequently raising the level of chaperone proteins. We can say that NAC may be a possible curative or supportive medication in the treatment of endometriosis.

N-asetil sistein, zamana ve doza bağlı kullanım ile endometriyotik hücrelerde migrasyon kapasitesini azaltır ve endoplazmik retikulum stresini artırır

GİRİŞ ve AMAÇ: Endometriyozis üreme çağındaki kadınları etkileyen ve kısırlık ve pelvik ağrı ile bağlantılı kronik bir hastalıktır. Hastalık için henüz iyileştirici bir tedavi olmayıp, sadece laparoskopi yapılmakta, anti-inflamatuar ilaçlar ve analjezik ilaçlar verilmektedir. Bir antioksidan olan N-asetilsistein (NAC), glutatyonu (GSH) geri kazandırır. N-asetilsistein, az sayıda çalışmada hem in vivo hem de in vitro endometriyozisi tedavi etmek için kullanılmıştır. In vivo ve in vitro çalışmalar, NAC’nin inflamasyonu ve ektopik endometriyal gelişimi azalttığını göstermiştir. Bu çalışmada, NAC’nin IC50 seviyesini kullanarak endometriyotik hücrelerin proliferatif kapasitesinin yanı sıra migrasyon davranışını da azaltmayı amaçladık.
YÖNTEM ve GEREÇLER: HESC ve 12Z insan endometriyal ve endometriyotik stromal hücre hatları, üreticinin talimatlarına göre üretildi. Hücresel empedansı belirlemek için xCELLigence (RTCA) cihazında empedans ölçümleri yapıldı. Hücrelere 10-6-10-12 M arasındaki dozlarda N-asetil sistein uygulandı ve NAC için IC50 hesaplandı. Hücreler IC50 NAC ile muamele edildi ve yara iyileşmesi 0, 24 ve 48. saatlerde analiz edildi. GRP78, ER işaretleyici ve tubuline özgü immünofloresan işaretlemeler yapıldı. Her örnek için düzeltilmiş toplam hücre floresansı (CTCF) hesaplandı. İstatistiksel analiz için GraphPad Prism 8 programı kullanıldı. Shapiro-Wilk testi, Mann-Whitney U testi, Kruskal-Wallis testi ve posthoc Dunn testleri yapıldı.
BULGULAR: 12Z hücrelerinin çoğalması 10-6-10-12 M NAC ile azalırken HESC hücrelerinin çoğalması etkilenmedi. 12Z hücreleri için IC50, 3.87 x 10-9 M olarak belirlendi. NAC ile tedavi edilen 12Z hücrelerinin yara aralığı genişliği, migrasyon testinin 48. saatinde kontrolünkinden önemli ölçüde daha genişti. N-asetil sistein ile muamele edilmiş 12Z hücrelerinde, artan ER-işaretleyici ve GRP78 immünofloresan işaretleme gözlendi, ancak tübülin işaretlenmesi azaldı. N-asetil sistein, HESC hücrelerinde bu proteinler için immünofloresan işaretlenmesini önemli ölçüde değiştirmedi.
TARTIŞMA ve SONUÇ: Endometriyozis, öncelikle üreme çağında olan kadınları etkileyen ve kısırlıkla bağlantılı ciddi, süreğen bir hastalıktır. Bu nedenle, NAC’nin zaman-doz ve empedansa bağlı şekilde uygulanmasının, endometriyotik hücrelerin çoğalma ve göç etme kapasitesini azaltmaya, tubulin proteininin ekspresyonunu düşürmeye, ER stresini arttırmaya ve sonuç olarak şaperon proteinlerinin seviyesini yükseltmeye yardımcı olduğunu gösterdik. N-asetil sisteinin endometriyozis tedavisinde olası bir iyileştirici veya destekleyici ilaç olabileceğini söyleyebiliriz.