Su örneklerinde norovirüs varlığının cross-flow mikrofiltrasyon ve RT-PCR ile belirlenmesi

Amaç: Ülkemizde; halk sağlığını tehdit eden gastroenterit salgınların kontrol altına alınması ve salgın kaynağının tespit edilmesine yönelik su örneklerinden norovirüs varlığının cross-flow mikrofiltrasyon ve RT-PCR (Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ile belirlenmesi için kullanılacak yöntemin uygulanabilirliğinin sağlanması amaçlanmıştır.
Yöntem: Çeşitli hacimlerdeki su örnekleri içerisine belirlenmiş farklı miktarlardaki Mengo kontrol virüsü (4,21x10-5copy/µL) ile klinik örneklerden izole edilmiş Norovirüs GII izolatları eklenmiştir. Bu su örnekleri, 10-30 kD’luk nominal moleküler ağırlıklı filtre kasetler kullanılarak cross-flow mikrofiltrasyon ile filtrasyon işlemi ve filtrasyon işlemi sonrası santrifüj işlemi uygulanmıştır. Santrifüj işlemi sonrası elde edilen süpernatant kısımdan QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Crawley - UK) üreticisinin talimatları doğrultusunda uygulanarak viral RNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. İzole edilen viral RNA’nın amplifikasyon işlemi ise RT-PCR kit (Ceeram, Fransa) kullanılarak RT-PCR ile yapılmıştır.
Bulgular: Su örneklerine eklenen Mengo kontrol virüsü ve Norovirüs GII izolatları sırasıyla filtrasyon, santrifügasyon, viral RNA izolasyonu ve amplifikasyonu işlemi uygulanmıştır. Çalışmamızda, virüs miktarındaki geri kazanım oranının %20-25 arasında olduğu görülmüştür. Virüs miktarındaki geri kazanımın düşük olmasının sebebinin filtrasyon işleminin olduğu görülmüştür. Çalışmamızda; virüs kayıplarını minimize etmek için filtrasyon işlemi sonrası santrifüj işleminin uygulanmasının gerekliliği ortaya çıkarmıştır. 10 veya 30 kD’luk nominal moleküler ağırlıklı filtre kasetler kullanılarak filtrasyon işleminin yapılmasının virüs miktarındaki geri kazanıma etkisinin olmadığı ortaya çıkmıştır.
Sonuç: Su örneklerinde norovirüs varlığının RT-PCR ile belirlenmesinde, filtrasyon aşamasının önemli bir yer tuttuğu görülmüştür. Virüs kaybının önlenebilmesi için büyük su hacimlere gereksinim duyulmaktadır.

Determination of norovirus in water samples by cross-flow microfiltration and RT-PCR

Objective: It is aimed to detect of the method to be applied for norovirus in water samples by RT-PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction) and cross-flow microfiltration to determine the origin of epidemic and to control gastroenteritis epidemics that are a threat to public health in our country.
Methods: Different amounts of Mengo control viruses (4.21x10-5copy/µL) and Norovirus GII isolates from clinical samples were added to various volumes of water samples. These water samples were first filtrated with cross-flow filtration using 10-30 kD nominal molecular weighed filter cassettes and then centrifuged. After centrifugation, viral RNA isolation was performed from the supernatant layer according to the instructions of QIAamp Viral Mini Kit (Qiagen Crawley - UK) producer. Amplification of isolated viral RNA was performed with RT-PCR by using RT-PCR kit (Ceeram, France).
Results: Filtration, centrifugation, viral RNA isolation and amplification were applied respectively to the water samples which Mengo control viruses and Norovirus GII isolates were added. In our study, it was seen that recovery ratio of virus amount is among 20-25% range. It is seen that the main reason of poor recovery is the filtration process. This study showed us that it is necessary to apply centrifugation after filtration to minimize virus loss. Using 10 or 30 kD nominal weighed filter cassettes for filtration made no effect to virus recovery.
Conclusion: It is seen that filtration is an important step in detection of norovirus in water samples with RT-PCR. Large volumes of water samples are needed to avoid virus loss.